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在細(xì)胞傳代培育過程中的原則、注意事項(xiàng)
發(fā)布時(shí)間： 2019-07-30 點(diǎn)擊次數(shù)： 1728次在生物醫(yī)學(xué)試驗(yàn)中常常會(huì)用到細(xì)胞系，指原代細(xì)胞培育物經(jīng)傳代成功后所繁衍的細(xì)胞群體。也指可長期連續(xù)傳代的培育細(xì)胞。細(xì)胞系是經(jīng)過細(xì)胞傳代或續(xù)代培育是將細(xì)胞從現(xiàn)有的培育物分隔或分出來開端新的培育，并參加新鮮培育液來促進(jìn)擴(kuò)增的常用手法?？墒羌?xì)胞系與新分離的或原代細(xì)胞的培育條件相類似，但也有一些根本不同的當(dāng)?shù)兀?br />
（1）每個(gè)細(xì)胞系需求其特定的成長因子混合物
（2）與原代細(xì)胞比較，它們的成長需求更嚴(yán)密的監(jiān)測，由于使它們無限成長的突變同時(shí)也會(huì)形成它們很快到達(dá)過度成長。因而，當(dāng)細(xì)胞系成長到了簡直覆蓋整個(gè)培育器皿底部，也便是90%的密度時(shí)，細(xì)胞需求重懸洗滌用于試驗(yàn)或凍存以備將來運(yùn)用，或許重新接種到新的培育器皿進(jìn)一步擴(kuò)增。
細(xì)胞換液注意事項(xiàng)：
首要要注意細(xì)胞培育液的色彩，富含營養(yǎng)的新鮮培育液由于添加了pH指示劑酚紅故為透明橙色。當(dāng)細(xì)胞耗盡培育液中的營養(yǎng)成分時(shí)，開端在培育物中堆集廢物和酸性物質(zhì)，下降pH值。因而，許多細(xì)胞培育液含有酚紅，當(dāng)培育物呈酸性時(shí)會(huì)將培育液色彩由橙色變?yōu)?。培育液需在變黃之前替換。當(dāng)酚紅變?yōu)榉奂t色時(shí)，說明培育基pH偏堿，不利于細(xì)胞健康成長。這時(shí)或許需求改變二氧化碳濃度并替換培育液。許多貼壁細(xì)胞系可天然附著于無涂層的塑料上。因而，塑料細(xì)胞培育板如培育皿或六孔板常常用于傳代細(xì)胞。塑料的細(xì)胞培育瓶也常常用到，如T25的細(xì)胞培育瓶，常用于擴(kuò)增培育數(shù)目少的細(xì)胞或許開端培育成長緩慢的細(xì)胞系。T75細(xì)胞培育瓶常用在培育擴(kuò)增速度較快的細(xì)胞系或用于成長超越T25培育瓶容量的很多細(xì)胞。在搬運(yùn)貼壁細(xì)胞時(shí)，要先剪切掉細(xì)胞上與和塑料結(jié)合的蛋白。因而，消化酶胰酶常用于消化細(xì)胞?？刂埔让赶臅r(shí)間很重要，由于假如處理時(shí)間過長會(huì)損壞細(xì)胞外表的蛋白。細(xì)胞培育液能中和胰酶。
所以在胰酶消化前常用磷酸緩沖液或PBS洗滌細(xì)胞。EDTA，一種鈣螯合劑有時(shí)候也用于提高胰酶的蛋白水解功能。為擴(kuò)增細(xì)胞克隆，將新鮮傳代的細(xì)胞培育于細(xì)胞培育箱中，挑選適合該細(xì)胞成長條件，一般為溫度37度，二氧化碳5％和濕度95%。
傳代的不同運(yùn)用：
人胚胎干細(xì)胞是一類有必要傳代的細(xì)胞。它們一般與小鼠成纖維細(xì)胞MEF共培育，后者能供給協(xié)助干細(xì)胞堅(jiān)持其多能性的因子。成善于養(yǎng)殖細(xì)胞上的干細(xì)胞到了適宜的發(fā)育階段時(shí)需挑出來?？捎梦⑿鸵埔汗芴舫龌蛴貌ＡЧぞ咻p輕將其刮下然后接種于新的培育液中進(jìn)行擴(kuò)增。有一些細(xì)胞系對酶消化靈敏，或許貼壁很緊無法運(yùn)用胰酶處理來重懸。細(xì)胞刮常用來輕輕將細(xì)胞從培育板的底部刮下來。假如細(xì)胞貼壁特別緊，可參加培育液或恰當(dāng)溶液后用血清吸管用力刮擦。運(yùn)用該方法時(shí)要當(dāng)心，細(xì)胞比較脆弱，容易在這種機(jī)械剝離的方法中受損。為了更快并可重復(fù)性的很多擴(kuò)增細(xì)胞到超越單層培育瓶容量的規(guī)模，可以運(yùn)用多層培育瓶，它的培育量可達(dá)單層培育瓶的3-5倍。
細(xì)胞傳代的操作步驟
首要，重要的是要清楚細(xì)胞需求監(jiān)測的頻頻程度，這取決于該細(xì)胞的擴(kuò)增速度?，F(xiàn)在培育液為亮橙色，再觀察其它成長情況。如培育液是否污濁-如污濁則或許有污染, 細(xì)胞的巨細(xì)和密度以及細(xì)胞的整體質(zhì)量。假如細(xì)胞密度到達(dá)90%，吸去細(xì)胞培育液，用無鈣離子和鎂離子的磷酸緩沖液洗滌。然后參加胰酶，置于37攝氏度約5分鐘，承認(rèn)細(xì)胞脫壁后，參加新鮮細(xì)胞培育液停止胰酶的水解。將懸浮的細(xì)胞搬運(yùn)到錐形管離心。細(xì)胞離心下來后，當(dāng)心棄去上清，重懸細(xì)胞于新鮮培育液。計(jì)數(shù)收集到的細(xì)胞然后依據(jù)適宜密度接種細(xì)胞當(dāng)即進(jìn)行擴(kuò)增或用于將來擴(kuò)增。