平時(shí)在實(shí)驗(yàn)室zui常聽到的一句話就是“今天某某試驗(yàn)沒做好是為什么？今天某某試驗(yàn)沒出結(jié)果是什么原因？今天某某試驗(yàn)為什么會(huì)是這樣的呢？” 等等。然后仔細(xì)一查找原因，往往是由于操作上面的不認(rèn)真，或是一些小小的細(xì)節(jié)沒有注意到。以下是集各路朋友的一些經(jīng)驗(yàn)，與大家分享：
1跑page膠的時(shí)候，小電壓跑會(huì)避免高電壓產(chǎn)生的熱量爾導(dǎo)致的膠層變形。低電壓泳道會(huì)比大電壓泳道跑的直一些，且分離效果更高，有利于分子量相差不大的蛋白分離。
2. 提取質(zhì)粒的時(shí)候，zui后一步的酒精揮發(fā)很關(guān)鍵，基本上是其后續(xù)的酶切反應(yīng)的決定性因素。所以這一步盡量揮發(fā)長一點(diǎn)時(shí)間，是空調(diào)吹熱風(fēng)，或是37度溫箱放長一點(diǎn)的時(shí)間，我試過室溫過夜，酶切很好。
3. 做WESTERN BLOT 的時(shí)候，大家往往會(huì)摸索一抗、二抗的濃度，封閉時(shí)間，曝光時(shí)間等等，而每次變換其中的一個(gè)條件就需要從新跑膠、轉(zhuǎn)膜，甚至重新提蛋白，這樣會(huì)浪費(fèi)大量的時(shí)間。其實(shí)*沒有必要這樣。一次轉(zhuǎn)膜后，將PVDF膜晾干，裁減成小塊，保存起來，用的時(shí)候取出一塊，沒有任何影響。這對(duì)于摸索條件的戰(zhàn)友來說，節(jié)約了大量的時(shí)間。
4. 有關(guān)緩沖液和培養(yǎng)基配置
1）將緩沖液配方中的成分分別以10－100倍配成母液儲(chǔ)存，需要的時(shí)候只需將相應(yīng)的母液混合，補(bǔ)加水稀釋即可
2）配培養(yǎng)基時(shí)通常會(huì)忘記各成分的量，如配LB時(shí)的三個(gè)成分不記得到底哪個(gè)是5g，哪個(gè)要10個(gè)，因此可以在常用的試劑瓶的標(biāo)簽上注明所需的量，如配LB時(shí)，在NaCl瓶外注明10g/L, yeast 5 g/L, tryton 10 g/L等，很方便，不需要每次配之前臨時(shí)翻書
5. 有關(guān)PCR主反應(yīng)液配置:

在做克隆鑒定的時(shí)候經(jīng)常需要在酶切鑒定前進(jìn)行PCR鑒定，每次配置PCR反應(yīng)液很繁瑣，可以將其配置類似kit的形式，按你需要的反應(yīng)體系列表，然后放大100倍配置100×主反應(yīng)液（100次反應(yīng)），其中含buffer，Mg2＋，dNTPs，但不含引物和Taq酶，然后可以10×分裝或一管儲(chǔ)存在－20度，在需要的時(shí)候拿出融開，然后按所需的PCR反應(yīng)個(gè)數(shù)吸取相應(yīng)的倍數(shù)，再補(bǔ)加相應(yīng)反應(yīng)倍數(shù)的Taq和引物，混勻后分裝，這樣做的好處如下：

1）可很大的節(jié)省寶貴的時(shí)間，可早點(diǎn)收工，看球
2）避免每次反應(yīng)加樣不均的可能
3）大大減少PCR假陽性的產(chǎn)生
6. 有關(guān)酶切反應(yīng)液的配置:

在做酶切時(shí)，也可以象PCR一樣配置主反應(yīng)液，每次反應(yīng)前先列好反應(yīng)的體系，算好需要的反應(yīng)數(shù)，然后按所需反應(yīng)的體系按所需反應(yīng)數(shù)放大，加入buffer、酶、水，質(zhì)粒欄空缺，然后混合后按除質(zhì)粒DNA的體積分裝，然后再在每管中加入相應(yīng)體積的質(zhì)粒DNA酶切，這樣做的好處如下，特別是當(dāng)同時(shí)有10幾個(gè)陽性克隆需要鑒定時(shí)尤為明顯：

1）各反應(yīng)成分均一
2）可大大減少限制型內(nèi)切酶的使用
3）節(jié)省時(shí)間
7. 有關(guān)SDS－PAGE：

1）可將SDS－PAGE的積層膠，分離膠預(yù)先配好大體積如100ml儲(chǔ)存在4度冰箱（注：10％AP，TEMED不加，切記！?。。?，每次配置時(shí)只需吸取相應(yīng)體積的預(yù)制膠加入AP，TEMED即可，沒必要每次制膠時(shí)候翻分子克隆，特別方便，而且，這樣的預(yù)制膠可儲(chǔ)存半年以上，不失為偷懶的方法；更關(guān)鍵的是可大大減少與丙稀酰胺的接觸，因此大大減少中毒的機(jī)會(huì)。

2）電泳時(shí)雖然小電泳分離效果要好一些，但2小時(shí)以上的等待的時(shí)間實(shí)在是痛苦，因此可以提高電泳至150V，但需要將整個(gè)電泳槽放在放滿冰水的臉盆里散熱，這樣跑出來的膠分離效果絲毫不比低電壓來的差，關(guān)鍵是時(shí)間大大節(jié)省，不需1h即可看結(jié)果了
8. 實(shí)驗(yàn)中小竅門我想能夠分成兩類：一類是“非常規(guī)”操作；一類是常規(guī)操作過程中一些省時(shí)省事手段。
前一類，我舉個(gè)例子：有時(shí)候*天涂的轉(zhuǎn)化平板、次日早晨轉(zhuǎn)化子可能長成的菌落比較大（1~2毫米以上，BL21就長得快），下一步轉(zhuǎn)化子做質(zhì)粒鑒定。這個(gè)情況下可以直接挑取一塊菌苔（勿帶出培養(yǎng)基），50微升酚/氯仿懸浮菌體，放置兩分鐘，加40微升TE抽提，上層TE吸出后再氯仿抽提一次，吸取上層TE即是質(zhì)粒提取液。提取的質(zhì)粒可以直接用于電泳和酶切。這樣操作，可以省去轉(zhuǎn)接液體試管的培養(yǎng)步驟，至少節(jié)省6~8小時(shí)的時(shí)間。但是，要在各步驟都控制得很好的情況下才能保證提取和酶切的效果，不同的實(shí)驗(yàn)室或者操作者未必能夠很方便地重復(fù)----其實(shí)，其它的一些“小竅門”也是如此。
后一類的小竅門則在實(shí)驗(yàn)室中無處不在。如：平行作不同樣本的PCR,模板DNA加量一樣，配置PCR體系可以一起配制后分裝----這點(diǎn)做過試驗(yàn)的都知道，但是配制的時(shí)候配制量可以比預(yù)期分裝量稍多一點(diǎn)（如用100微升則配110微升），這樣可以避免有時(shí)候分裝不夠的尷尬，因?yàn)椴煌貏e是大小不同的槍，會(huì)有誤差。再比如：樓上有站友說的sds-page膠預(yù)配（APS和TEMED、或者后者先不加）的問題，實(shí)際上時(shí)間放置過長肯定影響效果，如果要在一天內(nèi)連續(xù)地跑兩次板，何嘗不可？又比如，配sds-page膠的時(shí)候，上層膠和下層膠可以只用一個(gè)大槍頭：先取膠，次取水，取6.8的tris后再取8.8的tris，省時(shí)省料。
20021108站友開的這個(gè)帖子很好，在上上層樓的帖子說得也有道理。但我想，“竅門”和“偷懶”不應(yīng)該是因果關(guān)系。其實(shí)，不管是那一類的小竅門，都是在充分地理解實(shí)驗(yàn)各步驟的原理、經(jīng)過多次試驗(yàn)積累、再加上一點(diǎn)點(diǎn)思索然后嘗試的結(jié)果。知其然知其所以然和勤于思考敢于探索，是根本。否則，別人的小竅門對(duì)你也未必能夠有用。才進(jìn)實(shí)驗(yàn)室的新手，務(wù)必要先練好規(guī)范扎實(shí)的操作，然后才能弄“竅門”。本末倒置，貽害無窮。
9. 我一直是把SDS－PAGE的積層膠，分離膠預(yù)先配成mixture，APS制膠時(shí)加入，半年內(nèi)使用，沒有問題，我保證。
10. 做SDS-PAGE的時(shí)候，除了蛋白量上樣一致，體積也一致，這樣跑出來的膠各個(gè)泳道之間的band能做到一樣寬，方便后面的比較，特別是WB。做法就是拿1X的上樣緩沖補(bǔ)全要加的樣做到體積一致，否則跑出來會(huì)有的寬有的窄，特別是上樣體積相差較大的。
11. 在把蛋白膠做成干膠時(shí)，很多時(shí)候會(huì)因?yàn)橛袣馀菔鼓z裂掉，我的經(jīng)驗(yàn)是在做膠時(shí)加上層膜前在膠上多加些水就不容易進(jìn)氣泡了，還有就是高溫烘膠，我喜歡放到60度烘箱里烘，這樣水分蒸發(fā)速度快，即使有一些小的氣泡也不會(huì)有影響，呵呵，這是經(jīng)驗(yàn)之談，我從來都沒失手過，大家可以試試
12. 做大腸表達(dá)時(shí)確定蛋白是否表達(dá)一般要煮樣做誘前誘后檢測(cè),但很多時(shí)候煮出來的很黏影響跑膠效果.我發(fā)現(xiàn)如果現(xiàn)用8M Urea重懸細(xì)菌再煮效果會(huì)有很大改善.
注:不能用Gu-HCl代替
13. 我也推薦幾個(gè)偷懶的方法
1 做SDS-PAGE跑膠通常都是現(xiàn)配現(xiàn)用,但配膠要>1h,所以如果想第二天睡個(gè)懶覺而又不耽誤跑膠可以于前一天晚上做好濃縮膠和分離膠,待凝聚后不要拔下梳子,把含膠玻璃板從制膠槽取下,用保鮮膜包上,注意玻璃板上下兩邊緣會(huì)有氣體,所以需要加一點(diǎn)電泳緩沖液以避免膠內(nèi)水分蒸發(fā).然后放4度過夜.第二天直接拔下梳子行后續(xù).國外好多公司出售腳既是如此,可以保存上星期.

2 配置分離膠或者非變性膠時(shí)因膠凝時(shí)收縮可導(dǎo)致加樣孔變淺.可以將加剩的膠放入4度以降低凝聚速度,而將凝膠放入37度促聚,并隨時(shí)用4度加剩的膠補(bǔ)充下降的膠面.另外將膠橫放與水平面成~10度角也可以減少收縮的影響.

3 推薦一個(gè)節(jié)約抗體/時(shí)間的做法:
同時(shí)跑2塊膠,同時(shí)轉(zhuǎn)膜,然后兩塊膜背靠背放入同一封口膜同時(shí)封閉,同時(shí)一抗二抗（是用轉(zhuǎn)輪,這樣效果好.如果是搖床,隔一段時(shí)間幫它們翻個(gè)身以保證兩張膜的正面都有機(jī)會(huì)與液體充分接觸.一起洗膜（可以稍微加強(qiáng)洗膜也可以不做.我zui多一張盤子里放4張膜而沒有影響洗膜）.可分別或同時(shí)壓片.這樣就可以節(jié)約一半抗體和接近一半時(shí)間而不會(huì)影響結(jié)果.
或者另外一個(gè)就是孵育后的抗體不要扔,好的抗體可以反復(fù)做好幾張膜呢.但每次都會(huì)減弱,效果不如上面一種方法.
14.做western blotting 轉(zhuǎn)膜時(shí)，膠放在轉(zhuǎn)膜緩沖液中一段時(shí)間，待膠在含有甲醇的緩沖夜中縮小的差不多后裝好轉(zhuǎn)膜裝置，我的經(jīng)驗(yàn)是把膜印在膠上直接在膜上畫出預(yù)染maker條帶，方便的很。因?yàn)楹芏鄷r(shí)候跑電泳時(shí)膠上的預(yù)染maker很清楚，等轉(zhuǎn)膜后就不是分辨的很清楚了。不過要注意畫好預(yù)染maker后就不要使膠和膜發(fā)生對(duì)位移動(dòng)了，以防maker失去參照價(jià)值。
15. 超濾zui合適用于蛋白的濃縮，更換緩沖液和除鹽，對(duì)于按照分子量進(jìn)行初分離的效果不是很好，理論和現(xiàn)實(shí)是有很大差別的^_^
16. 關(guān)于Western Blot
1）器具的清潔非常重要，開始做前，為了安全，尤其是裝膠的厚薄玻璃板，可以先用中性洗滌劑和自來水反復(fù)沖洗，確保無洗滌殘液后用蒸餾水沖洗2－3遍，然后用去離子水沖洗一遍。zui后用95％酒精再擦一遍后晾干備用。
2）配膠現(xiàn)用現(xiàn)配，先配下層膠（分離膠），后配上層膠（濃縮膠或積層膠），而且在臨灌膠前加APS并迅速混勻，即用移液槍抽吸與注入1－2次即可。
17跑蛋白page的時(shí)候，一開始用加樣針，太麻煩，發(fā)現(xiàn)用20ul槍+普通小白槍頭點(diǎn)，非常省事。另外，點(diǎn)樣時(shí)有可能看不清孔在哪，看遠(yuǎn)離你的那面膠，孔有反光的。點(diǎn)樣也點(diǎn)你對(duì)面的那塊膠，省的總低頭，干咱這行的容易得頸椎呀，愛惜自己。
18. 垂直電泳時(shí)，可在電泳糟中放入青霉素小瓶等，可自然使液面提高而不影響電泳，又很節(jié)約電泳緩沖液。
19. 我們有時(shí)要沉淀東西時(shí)，由于沉淀量很少，離心完之后不知道到底有沒沉淀下來東西，由于量很少，不好觀察，所以離心時(shí)建議按特定的方向放置離心管，這樣你就可以在離心之前確定沉淀該沉淀到管子的大致部位，這樣離心后就可直接觀察那有沒有沉淀，避免滿管子找，另外看沉淀時(shí)可以對(duì)光看，這樣就是顆粒狀的細(xì)小沉淀也能看見的。
20. 大家都知道PMSF有劇毒，以前都是知道濃度和要配的體積的基礎(chǔ)上,算出要稱多少毫克的PMSF,其實(shí)也可以先稱PMSF,稱多少算多少,再調(diào)整異丙醇的體積，到達(dá)你所要的濃度。這樣就避免了你長時(shí)間和它接觸。
21. 跑好SDS-PAGE膠的一些體會(huì)。
1. 清洗好玻璃板，不要偷懶，很多時(shí)候跑完電泳撬膠時(shí)會(huì)因?yàn)椴ＡО宀桓蓛裟z粘在板上把膠撬破。
2. 配膠時(shí)不要反復(fù)用槍混，稍微搖混就可以了，用槍混多次會(huì)導(dǎo)致膠凝不好影響電泳圖的分辨率。
3. AP分裝成500微升一管保存放-20度，避免AP用太久失效。
4. 倒膠時(shí)把玻璃板中的水用濾紙盡量吸干，因?yàn)槲⒘康乃嬖跁?huì)影響配的膠濃度。
5. 盡量不用過夜放室溫或者四度的膠，也回影響膠 的分離效果。
6. 電泳完撬膠時(shí)根本不需要用撬膠板，在一平皿里裝好水，把有膠一面的放在水中晃動(dòng)幾次膠很容易就脫落下來，一點(diǎn)沒有問題，方便的很。
7. 點(diǎn)樣時(shí)樣品別忘了離心這步，因?yàn)樯蠘雍泄腆w沉淀會(huì)影響電泳圖分辨效果。
8. 盡量在冰浴狀態(tài)下跑。
22. 做　２－ＤＥ　做的比較多，總結(jié)了幾個(gè)小竅門：

１．一向電泳時(shí)，鹽離子容易聚在　膠槽的兩側(cè)．剪一小段ＩＰＧ膠條放在　　兩側(cè)，構(gòu)成鹽橋，電壓就容易上去了．避免一向電泳不好影響zui后實(shí)驗(yàn)　　結(jié)果．

２． SDS－PAGE時(shí),在灌膠之前,一般大家都會(huì)用凡士林封底, 在SDS－PAGE
電 泳之前又必須把凡士林搽干凈,很是麻煩,我的經(jīng)驗(yàn)是:不用凡士林,取少量未加Ap的分離膠,按比例加2倍量的Ap,然后灌入板間,等上幾分鐘,待膠凝固后就可以接著灌分離膠了.方面,效果好!
23. 蛋白質(zhì)純化時(shí)，蛋白質(zhì)降解可能與超聲破菌保持冰浴有關(guān)，之前建議加pmsf，建議在上柱子洗脫的時(shí)候也加pmsf（蛋白降解抑制劑），一定要用之前再加。
24. 做透析的時(shí)候，拿一個(gè)5ml的槍頭或者是其他類似的東西，剪短，穿過個(gè)塑料泡沫之類的面積比燒杯大東西，然后把透析帶一端扎緊，另一端開口綁緊在5ml槍頭下端，扎緊得那端也可以彎過來綁成u字型。這樣就可以用1ml的槍穿過5ml的槍頭的孔，另一只手調(diào)整透析帶，來加樣取樣，省去了總綁透析帶的麻煩，對(duì)同一個(gè)蛋白大量多次透析非常方便
25. *次發(fā)貼說一下自己的小經(jīng)驗(yàn)，希望版主能給我一分，每次看到好東西因?yàn)闆]分都沒法下，好羨慕有分的人啊。當(dāng)然也不能不勞而獲，說一下自己的實(shí)驗(yàn)技巧給大家分享。
1. 配SDS-PAGE膠時(shí)，用槍頭混勻比較麻煩，而且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，效果也不好。可以剪一小段夾文件的那種曲針做轉(zhuǎn)子放到配膠的小燒杯里，在磁力攪拌器上邊攪邊加入各溶液，這樣加完也就混勻了，直接灌膠即可。
2. 上面的站友也說過，上樣用黃槍頭就行，我也一直在用，根本不用注射器，方便的很，建議大家也試試。
3.電泳后考馬斯亮藍(lán)染色一般要1h到2h，脫色也要2h左右，麻煩的很。現(xiàn)在給大家說一個(gè)簡單的方法，是我從一個(gè)師姐那里學(xué)到的。

加入染色液后，先放入微波爐里加熱5-10秒，使染色液微熱即可（千萬不要加熱太久，否則冰醋酸就揮發(fā)了）。然后放水平搖床上搖20分鐘，zui多半小時(shí)就染好了。
脫色也很簡單，不用脫色液，直接用去離子水，放微波爐里煮沸5分鐘左右，然后將水倒掉，再換上新的去離子水煮，這樣反復(fù)幾次，就可以了。效果可能比正常的脫色稍差一點(diǎn)點(diǎn)，不如那樣清楚，只要電泳時(shí)比平時(shí)多上1/5的樣品就可以了，關(guān)鍵是這樣省時(shí)省材料（用不著含甲醇和冰醋酸的脫色液）。方便快捷！
放心，反復(fù)煮膠不會(huì)把膠煮壞的。
26. 我也說說我的小經(jīng)驗(yàn)?？赡艽蠹叶贾溃?qǐng)別笑話我。
1、配膠時(shí)一定要掌握好時(shí)間，不要因?yàn)檫^度趕時(shí)間，而造成以后的條帶粗大，壓不成條帶，且消耗很多試劑和時(shí)間。
2、加樣時(shí)，沖洗加樣器可用雙蒸水，用電泳液會(huì)使加樣器中有很多的泡沫?；蛟S是因?yàn)?span lang="EN-US">SDS的原因吧？
3、對(duì)于大分子蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜過夜更好。濾紙的張數(shù)可以適當(dāng)減少。
4、在跑樣時(shí)同時(shí)加入MARKER有助于正確識(shí)別所需的蛋白位置，減少NC膜的消耗。
5、一抗、二抗的濃度不要太高。
6、做ECL顯影時(shí)，根據(jù)熒光的亮度調(diào)整時(shí)間。泡完顯影液，膠片應(yīng)用水洗一下，以減少定影液變黃。
7、和有經(jīng)驗(yàn)的同學(xué)交流，也是非常重要的。知識(shí)的交流有助于試驗(yàn)的成功。
這是我目前的一點(diǎn)拙見。
27. 推薦一個(gè)省質(zhì)粒試劑盒硅膠柱與溶液的方法：
所有試劑使用手提質(zhì)粒自己配置的溶液一、溶液二、溶液三（代替試劑盒的solution1、2、3），然后一比一的與飽和碘化鉀或碘化鈉（代替結(jié)合緩沖液）混合，就可以讓質(zhì)粒在硅膠上結(jié)合，而試劑盒的硅膠柱可以重復(fù)使用，沒有試劑盒溶液量的限制，只要是一樣的質(zhì)粒我想提幾管就提多少。
順便說一句硅膠柱也可以用自己買的硅膠粉末代替，離心后倒掉硅膠柱上面的上清就可以，用起來不象柱子方便。效果比手提的要好要快。
28. 做WB時(shí),樣品比較多, 又怕放時(shí)間長了對(duì)蛋白樣品不好,而且確定以后肯定要做某個(gè)抗體,只是一時(shí)沒有決定.那么你可以選擇先做SDS-PAGE,并轉(zhuǎn)膜. 然后把PVDF膜涼干, 放四度保存. 以后拿出來封閉后,加抗體就行了. 蛋白在膜上,且已經(jīng)分離, 比保存在BUFFER里面的蛋白肯定更可靠。呵呵
29. 今天作his純化的時(shí)候，又琢磨了一個(gè)竅門，與大家分享。我得樣品比較多，幾百ml，而柱子不夠大，只有10幾ml，跑來跑去的上樣，還總得記著，太麻煩了。于是，我就刷干凈了一個(gè)燒杯，裝了我的樣品，找了一個(gè)細(xì)膠皮管，當(dāng)連通器，就像魚缸換水一樣，用5ml槍在一頭一吸，液體流出來，放到純化柱里，調(diào)好燒杯的位置，兩個(gè)液面一樣平了，呵呵，上了好幾個(gè)小時(shí)了，沒有問題，現(xiàn)在調(diào)低速度，過夜上樣：）
30. 能導(dǎo)致PAGE膠不凝的原因主要有三個(gè)：
1、配膠中用到的主要試劑的配置。
主要就是30％的丙稀酰胺的配置。 粉末狀的丙稀酰胺和甲叉丙稀酰胺使用不應(yīng)該超過一年，因?yàn)楸□０窌?huì)吸潮水解，這樣以來丙烯酸的含量就會(huì)加大，從而導(dǎo)致page膠不凝。
2、溫度。
溫度高時(shí)凝固快，但是亦不宜過高，因?yàn)闇囟茸兓瘯?huì)影響交連物的孔徑大小。所以溫度在25度zui為合適。
3、氧氣。
氧氣是凝固的終止劑，所以不能讓膠中出現(xiàn)氣泡。
雖然都是些看起來聽低級(jí)的錯(cuò)誤，但是不注意還是會(huì)犯。
31. 我做2維蛋白電泳，也有些心得：
1、向電泳玻璃板內(nèi)加入膠條時(shí)，先在縫隙中加入配好的溴芬蘭緩沖液，要加滿，再將膠條貼后面玻璃板壁用薄塑料片將膠條緩緩?fù)葡轮聊z上緣，這樣可以很好的避免膠條下形成空氣泡。
2、 能做出好的圖譜已經(jīng)很不容易了，如果在掃圖時(shí)撕破實(shí)在可惜，所以掃圖要小心，將凝膠轉(zhuǎn)移到掃描儀時(shí)可以用塑料隔片在下面托著，同時(shí)保持有些水，這樣就安全多了。
32. 湊個(gè)熱鬧說兩句吧

1、sds-page膠如果配好裝好倒入內(nèi)槽液以后，發(fā)現(xiàn)內(nèi)槽液稍有滲漏，可以把外槽液多加一些，加滿，加到與內(nèi)槽液相齊，這樣就可以繼續(xù)正常跑膠，不用浪費(fèi)已經(jīng)加進(jìn)去的內(nèi)槽液

2、至于染色脫色的問題，我們這里一直是染色：加熱半分鐘，搖20分鐘；如果染液不是新配的，就加熱半分鐘搖十分鐘，涼透了再重復(fù)一次即可
脫色也一直是用去離子水煮兩三次即可

3、不知道大家都是怎么做酶切的，我的體會(huì)是，酶切質(zhì)粒時(shí)，兩個(gè)酶分別單酶切比直接雙酶切效果要好很多。我有一次雙酶切兩次都沒連出來，后來分步單酶切，連接效率幾乎100%。
可以*個(gè)酶切完后直接把體系熱失活，（根據(jù)酶說明書上一般是65度20min）然后直接向里面補(bǔ)第二個(gè)酶
或者*個(gè)切完后用氯仿抽提，把蛋白提出
或者中間做一次回收，這個(gè)就要考慮回收效率和損失的問題了，但是這樣除蛋白zui*
前兩個(gè)方法我們這都是有人做過的，已經(jīng)都很好用了
33. 俺也來說說關(guān)于Bradford法蛋白濃度定量和DTNB法巰基濃度定量的一點(diǎn)體會(huì)：
我是做蛋白修飾巰基后，通過這兩種方法的定量來間接反應(yīng)修飾的程度。一路摸索過來，也有半年有余；zui大的體會(huì)就是不要急于求成，直接實(shí)驗(yàn)，首先檢測(cè)修飾體系是否對(duì)方法有影響，修飾基團(tuán)是否會(huì)在595nm和412nm下有特定的吸收，修飾后修飾試劑本身是否會(huì)有變化，對(duì)蛋白整體結(jié)構(gòu)造成影響，其次再談具體修飾比例和程度。對(duì)于巰基濃度測(cè)定方法，有四種（Anal Biochem. 1998 Dec 1;265（1）:8-14），而DTNB本身雖然靈敏度不高，但是重復(fù)性和抗干擾是*的了。
34. 考馬斯亮藍(lán)染色后的脫色，如在脫色液中加數(shù)張捏成條狀的Kimwipes紙（國外實(shí)驗(yàn)室常用，相當(dāng)我們的擦鏡紙，全棉纖維制造），由于染料吸附到紙纖維上，脫色加速。待紙著色較深時(shí)，更換新紙條，不用換液。我想脫脂棉或紗布也是一樣的。但濾紙等可能不行，會(huì)溶掉。

半貼壁細(xì)胞如SP/0或雜交瘤細(xì)胞傳代時(shí)，不用吹打或刮落。先將上清吸出，適當(dāng)拍打培養(yǎng)瓶（當(dāng)然是塑料瓶，玻璃瓶拍碎了別找我），即可見貼壁細(xì)胞脫落，加培養(yǎng)基混懸即可。注意，過力拍打培養(yǎng)瓶會(huì)裂，特別是瓶頸。
35. 一向電泳時(shí)，鹽離子容易聚在　膠槽的兩側(cè)．剪一小段ＩＰＧ膠條放在　　兩側(cè)，構(gòu)成鹽橋，電壓就容易上去了．避免一向電泳不好影響zui后實(shí)驗(yàn)　　結(jié)果．
36. 我也推薦幾條：
1、關(guān)于20021108戰(zhàn)友的說法，我覺得我們制備好了一批感受態(tài)，馬上轉(zhuǎn)化一種已知質(zhì)粒，與此同時(shí)，取一點(diǎn)感受態(tài)接種到含抗性的固/液體培養(yǎng)基培養(yǎng)來做對(duì)照。這樣第二天即可以知道這批感受態(tài)是否還有外源質(zhì)粒，又可以知道這批感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率的高低。如果合格，那以后就可以放心使用！因?yàn)槲乙苍?jīng)遇到其實(shí)是因?yàn)楦惺軕B(tài)不好而導(dǎo)致試驗(yàn)不成功，但是當(dāng)時(shí)不知道，結(jié)果費(fèi)時(shí)費(fèi)力。
2、做克隆挑斑時(shí)，我們可以在將沾有菌體的牙簽丟到試管前，在一塊相應(yīng)抗性的平板上點(diǎn)一下，標(biāo)注清楚，培養(yǎng)時(shí)間稍長一點(diǎn)，待長成較大菌落后收取。以后需要哪一個(gè)菌,就在平板上挑取。這樣既方便快捷，又可以保證菌的一致。
3、抽提質(zhì)粒時(shí)，加入Sloution II和III后要求輕柔混勻。我個(gè)人覺得不用這樣，只要不是非常劇烈，可以快速混勻。尤其可以運(yùn)用在一次抽提多管質(zhì)粒的時(shí)候，這樣可以快速，而且效果一點(diǎn)也不差。
4、抽提質(zhì)粒時(shí)，用無水乙醇沉淀的時(shí)間可以由實(shí)驗(yàn)操作者來決定，如果時(shí)間充?？梢?span lang="EN-US">30min，否則8-10min也可以。至于溫度，個(gè)人覺得-20度好于常溫。如果加入可醋酸鈉，會(huì)較容易形成鹽類雜質(zhì)，所以時(shí)間短一些更好！
今天想到這些，先寫到這里，以后想到了在上來與大家分享。希望我的小經(jīng)驗(yàn)對(duì)大家有所幫助！
37. 首先聲明：實(shí)驗(yàn)中的一些技巧要用在首先對(duì)基本的操作有深刻了解的基礎(chǔ)上，在力求省時(shí)、省力、節(jié)約成本等的同時(shí)，實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性是zui重要的。
對(duì)大多數(shù)做蛋白的戰(zhàn)友們來說，培養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)該是不陌生的，我這里談一個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞的小技巧，大家知道，對(duì)于一定的空間（如某種尺寸的細(xì)胞培養(yǎng)瓶）來說，細(xì)胞數(shù)目太多或者太少都不利于其生長，太多了就要消化，太少了要換一個(gè)小點(diǎn)兒的培養(yǎng)瓶，我的做法是：如果細(xì)胞數(shù)目太少，可以不必去找小一點(diǎn)兒的培養(yǎng)瓶，可把原來的培養(yǎng)瓶由原來的平放改為豎著放，這樣底部的空間就小了，有利于細(xì)胞的生長，當(dāng)細(xì)胞數(shù)目增加到一定程度的時(shí)候還可以在平過來，避免了來回?fù)Q培養(yǎng)瓶而增加污染的機(jī)會(huì)（對(duì)沒有小培養(yǎng)瓶的更實(shí)用）。
個(gè)人體會(huì)，僅供參考。
38. 說說關(guān)于SDS-PAGE的幾個(gè)小經(jīng)驗(yàn)

1、做好膠后，把所有的加樣孔都加上樣，這樣可以防止邊緣的樣品脫尾。

2、高電壓/高電流電泳時(shí)，可以把電泳槽放到4度冰箱中進(jìn)行電泳，省時(shí)省力，1hr搞定。

3、膠考染時(shí)間40min，放在凝膠搖床上（沒有膠床可以放到28度普通搖床上，但要控制好搖床速度）緩緩搖動(dòng)，使染色均勻，同時(shí)可提高檢測(cè)的靈敏度，根據(jù)我的經(jīng)驗(yàn)可以達(dá)到銀染的級(jí)別，就是脫色時(shí)間比較長，一般需要脫色2－3d，夏天的時(shí)候要勤換脫色液，防止變臭哦
39. 質(zhì)粒小提如果是用作鑒定或酶切，不必進(jìn)行酚仿抽提，將溶液1.2.3 離心后的清液移入一個(gè)新的1.5ml離心管中，再次離心3-5分鐘，小心取出上清液后，直接沉淀，不必?fù)?dān)心DNA切不開，我已經(jīng)這樣使用一年多，沒出過什么問題。當(dāng)然這樣的質(zhì)粒不很干凈，但是做鑒定足夠了。尤其是實(shí)驗(yàn)室女同胞們，可以減少酚仿的侵害，而且節(jié)省時(shí)間。