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測(cè)序常見問題及其分析
發(fā)布時(shí)間： 2010/4/15 點(diǎn)擊次數(shù)： 3066次提 供 商： 研域（上海）化學(xué)試劑有限公司 資料大?。?/td> 圖片類型： 下載次數(shù)： 22 次 資料類型： 瀏覽次數(shù)： 3066 次 相關(guān)產(chǎn)品： 詳細(xì)介紹： 1、PCR產(chǎn)物測(cè)序時(shí)出現(xiàn)重疊峰
問題圖1（模板中有堿基缺失，往往是單一位點(diǎn)（1-1）或兩個(gè)位點(diǎn)（1-2）堿基缺失導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果移碼）
圖1-1
圖1-2
解決方法：將PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒（如T載體）中挑單克隆測(cè)序，或?qū)CR產(chǎn)物進(jìn)行PAGE純化（至少瓊脂糖充分電泳后切膠純化）后再進(jìn)行測(cè)序。
問題圖2（PCR產(chǎn)物不純，含部分序列一致的兩種以上的片段，長(zhǎng)度不一）
圖2
解決方法：主要原因是PCR產(chǎn)物沒有純化，含有部分序列一致的兩種以上長(zhǎng)度不一的片段，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行PAGE純化（至少瓊脂糖充分電泳后切膠純化）后再進(jìn)行測(cè)序，便可解決。
問題圖3（測(cè)序引物有堿基缺失）
測(cè)序引物有堿基缺失（一般是引物的5'端缺失），和模板的堿基缺失即圖1有些類似，所不同的是模板堿基缺失一般是在一段正常測(cè)序序列后才出現(xiàn)移碼，而引物堿基缺失的話，則從測(cè)序一開始就出現(xiàn)移碼，表面在圖形上便是一開始就是嚴(yán)重的峰形重疊。
解決方法：重新合成引物，或?qū)⒁镞M(jìn)行PAGE純化
2、克隆測(cè)序時(shí)出現(xiàn)峰形重疊
原因：所挑選的重組子不是單克隆，所提供的測(cè)序用質(zhì)粒中含有兩種以上插入片段不同的質(zhì)粒；或是是送測(cè)序的菌液污染
解決方法：重新挑單克隆的菌落（劃線分離單菌落），提質(zhì)粒或送菌液再次測(cè)序。
3、樣品有雜合/突變位點(diǎn)
模板中有雜合型突變，也就說模板本身在這個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)突變；或者是從基因組中擴(kuò)增出來的雜合位點(diǎn)。如果模板有雜合（突變或缺失），那么測(cè)序圖形中其他的位點(diǎn)一般都是單一的峰形，然后突然在某一個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)重疊峰（如圖中箭頭所示）。
解決方法：建議將DNA片段克隆到載體再測(cè)序。
4、polyA/T和C/Gcluster導(dǎo)致的套峰和測(cè)序信號(hào)衰減
圖4-1
圖4-3
圖4-4
RACE測(cè)序時(shí)經(jīng)常遇到圖4-1和圖4-4的情形，解決方法：從另一端測(cè)序；但如果這樣的序列出現(xiàn)在中間，呵呵，目前還沒有很好的解決方法，要看測(cè)序公司的本事了。
C/Gcluster在PrV基因組測(cè)序時(shí)遇到過。后來還是讓TaKaRa公司給解決了，雖然不喜歡鬼子，但有時(shí)候卻不得不用它們的產(chǎn)品和服務(wù)。
5、基因中含有重復(fù)序列
可能的原因:樣品中含有重復(fù)序列導(dǎo)致的測(cè)序結(jié)果和PolyA/T的結(jié)果一樣，會(huì)導(dǎo)致Frame滑動(dòng)，較短的重復(fù)序列會(huì)導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)移碼；而較長(zhǎng)的重復(fù)序列會(huì)使定序信號(hào)衰減。
解決辦法:反向測(cè)序有時(shí)能夠順利的通過重復(fù)序列區(qū)域（但不是一定都能夠），通過多次的測(cè)序結(jié)果比對(duì)，拼接可以得到全序列結(jié)果。